400-852-8526
慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，包括8種能夠感染人和脊椎動物的病毒，原發(fā)感染的細(xì)胞以淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主，感染個體最終發(fā)病。慢病毒感染患者早期很難觀察，大多經(jīng)歷長達(dá)數(shù)年的潛伏期，之后緩慢發(fā)病，因此稱為慢病毒（Lentivirus）。慢病毒通常與免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性疾病有關(guān)，如人類免疫缺陷病毒（HIV）會導(dǎo)致艾滋病。
慢病毒載體是以慢病毒基因組為基礎(chǔ)，對其自身元件進(jìn)行改造而發(fā)展起來的一類能夠攜帶外源基因的病毒載體。根據(jù)來源，主要有HIV-1、HIV-2、SIV等不同類型，其中HIV-1型載體系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。
與其他病毒相比，慢病毒有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：
宿主更廣泛
對于分裂和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。對于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
穩(wěn)定表達(dá)
慢病毒基因組可整合于宿主基因組，因此可以長時間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因。
可攜帶大約5kb或更長的外源基因片段
基于慢病毒載體的優(yōu)點(diǎn)，其被廣泛應(yīng)用于RNAi、基因治療以及轉(zhuǎn)基因動物等研究中。體外構(gòu)建能夠表達(dá)siRNA的慢病毒載體，然后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，使其在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA，可發(fā)揮長期阻斷基因表達(dá)的作用。同時，以慢病毒作為基因載體的多種基因療法已在國內(nèi)外開展臨床研究，效果非常理想，在基因治療中擁有廣闊的應(yīng)用前景。
當(dāng)使用慢病毒載體感染細(xì)胞時，通常需要濃縮病毒顆粒以獲得高滴度，特別是需要感染大量細(xì)胞或者用于某些對轉(zhuǎn)導(dǎo)具有抵抗力的細(xì)胞系時。離心是濃縮病毒的一種簡單有效的方法，這里我們介紹兩種常用的濃縮慢病毒載體的方法。
PEG濃縮法
聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一種無電荷的線性分子結(jié)構(gòu)的多糖，為乙二醇的聚合物，具有高親水性，在溶液中會吸收大量水分，減少病毒之間的距離，使病毒聚合在一起，提高病毒的相對濃度，達(dá)到沉淀濃縮的目的。
基本流程：
收集病毒上清液，使用0.45 μm濾膜過濾，除去細(xì)胞及細(xì)胞碎片。
將上清液與40% PEG溶液混合（可使用PEG8000、4000或6000），最終PEG濃度為10%。冰上放置3到6小時。
放于Avanti J-15R離心機(jī)中，2000 ×g 離心30 min。
去掉上清，使用1/20原始樣品體積的PBS緩沖液對離心后形成的沉淀進(jìn)行重懸。
為了進(jìn)一步濃縮，將重懸后的病毒樣品轉(zhuǎn)移到已預(yù)先消毒的超速離心管（Ultra-Clear Tube #344058）中，并使用PBS緩沖液進(jìn)行配平。
（注：可選用無菌無酶離心管 #C14292）
按次序?qū)⒊匐x心管放置于SW 32 Ti的吊桶中。
將裝有病毒樣品的SW 32 Ti轉(zhuǎn)頭放置于Optima XPN-100超速離心機(jī)中，100,000 ×g（24,500 rpm）離心90 min。
直接傾倒或使用移液器小心去除上清，注意不要將病毒顆粒倒出。
使用PBS或其他病毒存儲液重懸沉淀，并將所有管中的樣品集中在一個離心管中。
集中的病毒樣品分裝后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/span>
蔗糖墊液離心法
為更好地保持病毒顆粒形態(tài)與結(jié)構(gòu)的完整性，超速離心濃縮時經(jīng)常在管底加入蔗糖墊液，使病毒樣品在到達(dá)管底時沉降減速或不形成沉淀。
基本流程：
收集病毒上清液，使用0.45 μm濾膜過濾，除去細(xì)胞及細(xì)胞碎片。
在已預(yù)先滅菌的超速離心管（Ultra-Clear Tube #344058）底部小心加入3-5 ml 20%蔗糖墊液。
（注：可選用無菌無酶離心管 #C14292）
小心地將病毒上清液加至離心管中蔗糖墊液上。
將超速離心管配平后小心放入吊桶中。
將裝有病毒樣品的SW 32 Ti轉(zhuǎn)頭放置于Optima XPN-100超速離心機(jī)中，4℃，125,000 ×g離心90 min。
直接傾倒或使用移液器小心去除上清，注意不要將病毒顆粒倒出。
加入PBS或其他病毒存儲液重懸沉淀，可選擇在4℃下溶解2小時，每20分鐘輕輕震蕩。
對離心得到的病毒樣品進(jìn)行分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/span>
點(diǎn)擊了解
“OPTIMA XPN 系列超速離心機(jī)”
Optima XPN-100
最高轉(zhuǎn)速：100,000 rpm
******相對離心力：802,400 ×g
15寸液晶顯示屏
內(nèi)置離心專家軟件
SW 32 Ti 水平轉(zhuǎn)頭
最高轉(zhuǎn)速：32,000 rpm
******相對離心力：175,000 ×g
******容量：6 × 38.5 mL
安全、高效的插入式轉(zhuǎn)頭
參考文獻(xiàn)：
1. https://baike.baidu.com/item/慢病毒
2.https://media.beckman.com/-/media/pdf-assets/application-notes/centrifuge-application-note-lentiviral-vector-preparation-ultra.pdf
聲明：本微信公眾號歸屬貝克曼庫爾特生命科學(xué)，歡迎個人轉(zhuǎn)發(fā)分享，其他任何媒體、網(wǎng)站如需轉(zhuǎn)載或引用本公眾號版權(quán)所有內(nèi)容使用本賬號或從本賬號下載內(nèi)容都表明您同意遵守以下聲明：本賬號包含的所有內(nèi)容，包括但不限于內(nèi)容的選擇、結(jié)構(gòu)或設(shè)計均由貝克曼庫爾特生命科學(xué)或其許可方所有，且受著作權(quán)法等其他知識產(chǎn)權(quán)法和反不正當(dāng)競爭法的保護(hù)。您能出于個人目的從本公眾號轉(zhuǎn)載內(nèi)容，如您以商業(yè)目的下載、轉(zhuǎn)載并使用本公眾號的內(nèi)容，須同時滿足以下條件：（1）未對該等內(nèi)容作任何方式修改；（2）保留所有的版權(quán)和其他所有權(quán)聲明；（3）并且當(dāng)您展示或以其他方式使用該內(nèi)容時，必須標(biāo)注“轉(zhuǎn)自：貝克曼庫爾特生命科學(xué)”。對本聲明的任何違反均構(gòu)成違法及不公平的商業(yè)行為，貝克曼庫爾特生命科學(xué)保留依照相關(guān)法律及規(guī)定向侵權(quán)者追究法律責(zé)任的權(quán)利。
