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Exosome外泌體是細胞外泌囊泡中體積較小的一種。近幾年，人們發(fā)現(xiàn)這種微小膜泡中含有細胞特異的蛋白、脂質(zhì)和核酸，能作為信號分子傳遞給其他細胞從而改變其他細胞的功能。外泌體在很多生理病理起著重要的作用，如免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復(fù)等。不同的細胞分泌的外泌體具有不同的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標志物，也可用于靶向藥物的定向傳輸。
樣本準備：外泌體分離需要多少起始材料？
成功分離外泌體所需的起始材料，取決于你所研究的體液、所選擇的分離方法以及將進行的下游分析。外泌體的濃度隨體液類型和疾病狀態(tài)而異。最好對目標體液和疾病所涉及的外泌體濃度進行評估。知道樣品所含外泌體的濃度之后，你還需要了解自己所選外泌體分離方法的效率，你可以采用標準化外泌體樣品或微球進行計算， 然后可以反推計算達到所需的總體積，其中考慮到樣品損耗和外泌體裂解引起的外泌體損耗。成功分離外泌體后，你希望確保所選下游分析具備足夠的起始材料（DNA、RNA、蛋白質(zhì)）?，F(xiàn)有方案的初始體積范圍最低為3～4mL，最高為50mL。
制備方法：用什么方法分離外泌體，以及如何表征這種混合的外泌體群體？
過濾后采用低轉(zhuǎn)速除去完整細胞、細胞碎片和大聚集體。使用轉(zhuǎn)頭速度超過100,000×g 的貝克曼超速離心機高速離心處理2小時以上，可以沉淀、濃縮外泌體。
如需對外泌體群體進一步純化分離，建議以轉(zhuǎn)速為100,000×g的5～40% 碘克沙醇非連續(xù)性密度梯度離心法處理18小時以上。分離外泌體并確認其回收率之后，在臺式超速離心機中以超過100,000×g的轉(zhuǎn)速處理外泌體1.5～2小時，即可令外泌體沉淀。外泌體群體一般通過光散射法、二代基因測序法及蛋白質(zhì)印跡法進行表征。
儲備條件：樣品儲存條件（包括從不同來源分離出來的外泌體溫度），以及外泌體分離前生物體液和細胞培養(yǎng)樣品的儲存條件？
使用的純化外泌體儲存在 -20℃ 條件下，而長期儲存的溫度則為 -80℃。我們尚未發(fā)現(xiàn)不同外泌體來源在儲存條件影響方面存在任何差異。
大多數(shù)生物體液（尿液、精液、唾液等）可以在分離外泌體之前存放于 -80℃ 條件下。對于細胞培養(yǎng)，大多數(shù)細胞系在37℃、5% CO2條件下儲存。
內(nèi)含物表征：如果我們進行以下操作，總共需要花多長時間？
1、從細胞培養(yǎng)基和血漿中提取外泌體
首先是3個不同的沉淀步驟，共需2個小時，接著進行隔夜密度梯度離心步驟，目的是分離出細胞培養(yǎng)基或血漿中的外泌體。
2、RNA分離、NGS和分析
用Biomek 4000分離RNA約花費3小時，接著是特定RNA類型的富集（供NGS使用）。NGS和分析高度取決于所采用的系統(tǒng)和所進行的分析類型。
外泌體分離純化的金標準
超速離心分離是從生物體液和細胞培養(yǎng)樣品中分離純化外泌體的黃金標準，可以準確地重復(fù)獲取外泌體，同時******限度減少蛋白質(zhì)聚集體和其他膜粒子的共純化。
Exosome的離心純化標準流程
差速離心富集法
密度梯度離心法
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